关于进境鸵鸟检疫有关问题的通知 （动植检动字〔1996〕87号）

关于进境鸵鸟检疫有关问题的通知

（动植检动字〔1996〕87号）

各直属口岸动植物检疫局、动物检疫所：

近年来，鸵鸟的引进和繁养在我国呈现了迅猛发展的势头，为满足引进鸵鸟及其种蛋的需要，一年多来，我们先后与美国、加拿大、法国、荷兰、津巴布韦、博茨瓦那、澳大利亚和纳米比亚签署了进境鸵鸟的检疫和卫生条件议定书，从而为引进鸵鸟在检疫方面铺平了道路。随着鸵鸟的大量引进，我们的检疫工作也日趋繁重，而鸵鸟的检疫在我国还是个崭新的课题，为总结近年来进境鸵鸟的检疫经验，进一步提高检疫水平，防止疫病随进口鸵鸟及其种蛋传入我国，使鸵鸟的检疫工作更加规范化和标准化，保证进境鸵鸟检疫工作的顺利进行，现就进境鸵鸟及其种蛋入境后的检疫工作的有关问题通知如下：

一、进境鸵鸟检疫

1.鸵鸟入境后须在口岸动植物检疫局指定的隔离场所进行为期45天的隔离检疫，如须延长隔离检疫时间，须报国家局批准。

2.鸵鸟运抵隔离场一周后，逐只进行采血采样，并分成两份，其中一份保存备查，并注意编号。

3.隔离检疫期间的实验室检疫项目，主要依照我国与输出国缔结的鸵鸟检疫议定书规定的实验室检疫项目进行。如发生特种情况可做特殊检疫项目。

4.实验室检疫的操作试行程序附后。

二、进境鸵鸟种蛋检疫

1.进境种蛋的孵化厂须获得口岸动植物检疫机关的认可。

2.进境鸵鸟种蛋在入孵前，须用有效的消毒药进行熏蒸处理。

3.进境种蛋不得与其他种蛋一同孵化。

4.首次孵出的小鸟须在口岸动植物检疫机关认可的场所由口岸检疫机关隔离检疫30天，在此期间采样并依照我国与输出国缔结的鸵鸟种蛋的检疫议定书规定的项目作实验室检疫。

三、其他未尽事宜按《进境动物检疫管理办法》执行。

四、在执行过程中有何问题，请及时上报国家局。

附件：鸵鸟疫病实验室检疫操作试行规程

中华人民共和国动植物检疫局

一九九六年八月二十六日

鸵鸟沙门氏菌泄殖腔拭子培养规程（试行）

一、材料：

灭菌棉拭子、缓冲蛋白胨水、亚硒盐胱氨酸增菌液、胆硫乳琼脂、三糖铁琼脂、生化试验管、多价血清因子、细菌培养必需设备。

二、操作方法：用无菌棉拭子从泄殖腔取样，放无菌瓶中，尽可能冷藏于2～4℃，编号后送实验室检验。

三、实验室检验：

鸵鸟鹦鹉热间接血凝（IHA）操作规程（试行）

一、本规程适用于鸵鸟衣原体病的诊断。

二、材料

衣原体属抗原致敏绵羊红细胞

标准阴、阳性对照血清

被检血清：采集鸵鸟血清，试验前于56℃水浴灭活30分钟。

90度V型反应板

灭菌生理盐水

微量加样器

三、试验方法

1.将生理盐水滴于V型反应板中，每孔50ul。

2.取被检血清50ul于第一孔中，与生理盐水混匀后吸50ul于第二孔，依次作倍比稀释至1:16。

3.将1:8和1:16两孔各加25ul抗原，如作定量试验可根据实际需要自行决定。

4.对照试验：设阳性血清＋抗原、阴性血清＋抗原、生理盐水＋抗原各一孔。

四、血凝反应程度的标准：

“＋＋＋＋”：红细胞全部凝集，形成一层均匀的膜，布满整个孔底。

“＋＋＋”：红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者稍小。

“＋＋”：红细胞在孔底形成薄层凝集，边缘松散或呈锯齿状。

“＋”：红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点。

“＋”：红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。

“―”：红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。

“＋＋”以上的凝集判为阳性凝集。

五、结果判定

1.对照试验：出现如下结果试验方可成立，否则应重试，阳性血清＋抗原呈“＋＋＋＋”；阴性血清十抗原呈“-”；抗原十生理盐水。

2.被检样品判定标准：血清效价＞1:8（＋＋）判为阳性。

鸵鸟新城疫、禽流感、付粘病毒分离操作规程（试行）

本规程适用于新城疫、禽流感、付粘病毒的分离

一、材料

1.消毒棉拭子

2.灭菌试管

3.灭菌生理盐水

4.泄殖腔棉拭子保存液：PBS，PH7.2-7.4，青霉素1万单位/ml，链霉素10mg/m1，庆大霉素250ug/ml，制霉素5000u/ml。

5.SPF种蛋。

6.90度V型反应板。

7.微量加样器。

二、操作方法

1.将采集的泄殖腔棉拭子置于样品保存液中，置4℃过夜。次日3000rpm离心10min，上清液作菌检后接种9～10日龄鸡胚（每胚0.2ml），37℃再孵育5天，去掉24小时死亡的鸡胚，其他鸡胚放4℃冷却后，检测鸡胚尿囊液的血凝滴度。如尿囊液的血凝反应呈阴性，应再用鸡胚盲传2代。

2.将收集的尿囊液用PBS以25ul量进行倍比稀释，加25ul的1%鸡红细胞，轻轻混匀，静置15～30min，判定血凝滴度。

如鸡胚尿囊液的血凝试验呈阳性，应分别用新城疫病毒、禽流感病毒、副粘病毒的阳性血清作血凝抑制试验以检测病毒的种类。

表一　鸡胚尿囊液血凝试验 （单位：ul）（略）

禽流感血凝抑制试验操作程序（试行）

一、试验材料

1.抗原：禽流感病素H5、H7型抗原；

2.阴、阳性对照血清。

3.红细胞：无菌采集鸡血液5～10ml于少许阿氏液中摇匀，以洗涤3～5次，每次3000rpm离心10min，将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮，再将沉淀的红细胞稀释成1%的红细胞悬浮液（RBC）；

4.被检血清：采集被检鸵鸟血液，离心分离血清，56℃灭活30min；

5.稀释液：灭菌的生理盐水或PBS（pH7.2～7.4）

6.90度V型反应板，微量加样器。

二、试验操作

1.血凝试验（HA）：

取干净的微量滴定板（V型）一块，按表一进行操作：每孔加25ul生理盐水，孔1加禽流感抗原25ul，用移液器反复吹打混匀三次；吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3；如此依次稀释到孔10，孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加抗原，只加生理盐水作空白对照。加入1%的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温；每5min观察一次，15～30min后判定结果，并作好记录。

表一　禽流感血凝试验（单位：ul）（略）

抗原的血凝滴度是凡能使1%的鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数；因此，能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液25ul称为1个血凝单位（HA）。如该抗原的血凝单位为1:128/25ul。

在进行禽流感血凝抑制试验时，病毒的工作浓度应为8HA。因为该试验的抗原的血凝单位为1:128/25ul，按其孔号数（孔.7）倒退3孔的稀释倍数（孔4　1:16），作为该病毒的工作浓度：1:16/25ul。

2.血凝抑制试验（HI）：

取干净的微量滴定板（V型）一块，按表二进行操作：每孔加25ul生理盐水，孔1加待检血清25ul，用移液器反复吹打混匀三次；吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3；如此依次稀释到孔8，孔8混匀后吸出25ul弃掉。孔9作为阳性血清对照，孔10作为阴性血清对照，孔11不加任何血清而作为抗原对照，孔12不加抗原和任何血清，只加PBS作空白对照。各孔加入1%的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温；每5min观察一次，15～30min后判定结果，并作好记录。

未免疫的健康鸵鸟血清无血凝抑制作用，各稀释倍数均出现红细胞凝集现象；禽流感感染或免疫的鸵鸟血清能抑制禽流感病毒对红细胞的凝集作用。凡能使8HA的抗原凝集红细胞作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如表二的血凝抑制价为1:64）。

表二　禽流感血凝抑制试验（单位：ul）（略）

3.判定标准

1）判定时应首先观察各对照孔是否完全符合；

2）红细胞凝集：红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底，判为血凝作用为阳性“十”；

3）无凝集或凝集抑制：红细胞集中于孔底中央呈点状，判血凝作用为阴性“―”，或判血凝抑制作用为阳性；

4）血凝抑制价：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀释倍数；

5）被检血清的血凝抑制价在1:8以上者，判为阳性反应；

6）最后判定时间与感作时间有关。温度高时感作时间短，15min即可；温度低时可适当延长，但最长不得超过30min。

禽流感琼脂扩散试验操作规程（试行）

1.琼脂凝胶平板的制备：称取琼脂糖1g，氯化钠8.5g，加入100ml蒸馏水，10磅10分钟高压溶解后，冷却至45℃，加入0.01%叠氮钠，每个直径6CM平皿加7ml融化琼脂，厚度为2.8mm，待凝固后置冰箱内片刻。

2.打孔：中间一孔，周围六孔为一组，孔径3mm，孔居2.5mm。

3.加样：中心孔加抗原，周围1、3、5孔加阳性血清，2、4、6孔加被检血清。

4.加样后置湿盒内，于室温下感作。

5.结果判定：24小时初判，48小时终判，阳性对照成立时，进行判定。

阳性：被检血清孔与抗原孔之间出现致密沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端互相联接。

可疑：标准阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲。

阴性：抗原孔与被检血清孔之间不出现沉淀线或标准阳性血清与阳性孔间的沉淀线向毗邻的被检血清孔直伸或其外侧偏弯。

禽副粘病毒血凝抑制试验操作程序

一、试验材料

1.抗原：禽副粘病毒病毒Ⅱ型抗原；

2.红细胞：无菌采集鸡血液5～10ml于少许阿氏液中摇匀，以洗涤3～5次，每次3000离心10min，将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮，再将沉淀的红细胞稀释成1%的红细胞悬浮液（RBC）；

3.被检血清：采集被检鸵鸟血液，离心分离血清，56℃灭活30min；

4.稀释液：灭菌的生理盐水或PBS（pH7.2～7.4）

5.阴、阳性对照血清

6.90度V型反应板，微量加样器。

二、试验操作

1.血凝试验（HA）：

取干净的微量滴定板（V型）一块，按表一进行操作：每孔加25ul生理盐水，孔1加禽流感抗原25ul，用移液器反复吹打混匀三次；吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3；如此依次稀释到孔10，孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加抗原，只加生理盐水作空白对照。加入1%的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温；每5min观察一次，15～30min后判定结果，并作好记录。

表一　禽副粘病毒血凝试验（单位：ul）（略）

抗原的血凝滴度是凡能使1%的鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数；因此，能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液25ul称为1个血凝单位（HA）。如该抗原的血凝单位为1:128/25ul。

在进行禽副粘病毒血凝抑制试验时，病毒的工作浓度应为4HA。因为该试验的抗原的血凝单位为1:128/25ul，按其孔号数（孔7）倒退2孔的稀释倍数（孔5，1:16），作为该病毒的工作浓度：1:32/25u1。

2.血凝抑制试验（HI）：

取干净的微量滴定板（V型）一块，按表二进行操作：每孔加25ul生理盐水，孔1加待检血清25ul，用移液器反复吹打混匀三次；吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3；如此依次稀释到孔8，孔8混匀后吸出25ul弃掉。孔9作为阳性血清对照，孔10作为阴性血清对照，孔11不加任何血清而作为抗原对照，孔12不加抗原和任何血清，只加生理盐水作空白对照。各孔加入1%的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温；每5min观察一次，15～30min后判定结果，并作好记录。

表二　禽副粘病毒血凝抑制试验（单位：ul）（略）

未免疫的健康鸵鸟血清无血凝抑制作用，各稀释倍数均出现红细胞凝集现象；禽副粘病毒感染或免疫的鸵鸟血清能抑制禽副粘病毒对红细胞的凝集作用。凡能使8HA的抗原凝集红细胞作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如表二的血凝抑制价为1:64）。

3.判定标准

1）判定时应首先观察各对照孔是否完全符合；

2）红细胞凝集：红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底，判为血凝作用为阳性“十”；

3）无凝集或凝集抑制：红细胞集中于孔底中央呈点状，判血凝作用为阴性“-”，或判血凝抑制作用为阳性；

4）血凝抑制价：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀释倍数；

5）被检血清的血凝抑制价在1:8以上者，判为阳性反应；

6）最后判定时间与感作时间有关。温度高时感作时间短，15min即可；温度低时可适当延长，但最长不得超过30min。

鸵鸟新城疫血凝抑制试验操作规程（试行）

一、试验材料

1.抗原：选择对红细胞凝集作用强的鸡新城疫弱毒株接种鸡胚，收获尿囊液和羊水制备。

2.红细胞：采健康鸡血液5～10ml，于少许阿氏液中摇匀，以生理盐水洗3～5次，每次3000rpm离心5～10分钟，将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮，再将沉淀的红细胞用生理盐水稀释成1%的红细胞悬浮液。

3.被检血清：采集被检鸵鸟血液分离血清，试验前56℃灭活30分钟。

4.生理盐水：灭菌的生理盐水或PBS（pH6.5～7.2）。

5.90度V型反应板，微量加样器。

二、试验操作

1.血凝试验（HA）：

取干净的微量血凝反应板（V型）一块，按表一进行操作，每孔加生理盐水25ul，孔1加鸵鸟新城疫抗原25ul，用移液器反复吹打混匀三次；再吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3，依次稀释到孔10，孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加生理盐水作空白对照。然后加入1%的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温，每5分钟观察一次，15分钟后判定结果并作好记录。

抗原的血凝价为凡能使红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，即该病毒的血凝滴度。如表一血凝价为1:128，因此能使鸡红细胞完全凝集的最高稀释倍数和病毒液25ul为该病毒的1个血凝单位（HA），在进行血凝抑制试验时，病毒工作浓度为4HA。如该试验的病毒血凝价为1:128，按其孔号数（孔7）倒退两孔的稀释倍数（孔5），即该病毒液作1:32稀释。

2.血凝抑制试验（HI）：

取干净的微量血凝滴定板（V型）一块，按表二进行操作，每孔加生理盐水25ul，孔1加被检血清25ul，用移液器反复吹打混匀三次，再吸出25ul于孔2，吹打混匀后吸出25ul于孔3，依次稀释到孔8，孔8混匀后吸出25ul弃掉，孔9作为阳性血清对照，孔10作为阴性血清对照，孔11不加血清作为抗原对照，孔12不加生理盐水作空白对照。然后各孔加入含4HA的抗原25ul，充分振荡后室温静置感作5～6分钟；再加入1%的红细胞悬浮液25ul，充分振荡后置于室温，每5分钟观察一次，15分钟后判定结果，并作好记录。

健康鸵鸟血清无抑制作用，各稀释倍数均无红细胞凝集现象；感染鸵鸟或免疫鸵鸟血清能抑制对红细胞的凝集作用，凡能使4HA的抗原凝集红细胞作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如表二的血凝抑制价为1:64）。

3.判定标准

1）判定时应首先观察各对照孔是否完全符合。

2）红细胞凝集：红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底，判血凝作用为阳性（十）。

表一　新城疫血凝试验（单位：ul）（略）

表二　新城疫血凝抑制试验（单位：ul）（略）

3）无凝集或凝集抑制：红细胞集中于孔底中央呈点状，判血凝作用为阴性（一），或判血凝抑制作用为阳性。

4）血凝抑制价：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制最高血清稀释倍数。

5）被检血清的血凝抑制价在1：32以上者，判定为阳性反应。

6）最后判定时间与感作温度有关，温度高时需要时间短，15分钟即可，温度低时可适当延长，但最长不得超过30分钟。